ЭРИТРОПОЭТИН: ОТКРЫТИЯ И ДОСТИЖЕНИЯ
100 лет назад был впервые обнаружен этот гормон
Эритропоэтин, гормон эритропоэза, в
противоположность многим "классическим" гормонам, прошел длинный путь через
череду открытий и заблуждений к потрясающим научным и клиническим достижениям.
Несмотря на все былые неудачи, разочарования и трудности, этот "мифический" или
"неуловимый" объект неустанных поисков ученых стал реальностью, обрел
молекулярно-генетические очертания и, что особенно важно, нашел широкое
клиническое применение.
Сквозь сомнения и неудачи
Постоянный уровень эритроцитов в организме
поддерживается строгой координацией между образованием и разрушением клеток
красной крови (эритроидных клеток). В нормальных условиях эти противоположные
процессы находятся в состоянии устойчивого динамического равновесия, которое
поддерживается регуляторными механизмами. Долгое время считали, что фактором,
регулирующим эритропоэз, является величина кислородного напряжения в костном
мозгу. Предполагалось, что костный мозг даже в норме испытывает некоторое
кислородное голодание, которое оказывает прямое стимулирующее действие на
эритропоэз. Эта "гипоксическая" теория находила подтверждение в опытах и
наблюдениях, показавших резкое увеличение образования эритроцитов при понижении
парциального давления в воздухе, и, следовательно, в крови.
Однако прямое стимулирующее влияние гипоксии
на эритропоэз доказать не удалось. Напротив, выяснилось, что для усиления
деятельности эритроидного костного мозга необходимо нормальное или даже
повышенное содержание кислорода. После тщательных и многолетних исследований
удалось установить, что гипоксия стимулирует эритропоэз в костном мозгу не
прямо, а путем образования гуморального медиатора - эритропоэтина.
Столетие со дня рождения гипотезы о
гуморальной регуляции эритропоэза можно условно разделить на три периода: 1)
гуморально-клеточный, 2) молекулярно-генетический и 3) клинический.
В 1906 г. Carnot и Deflandre впервые
обнаружили, что сыворотка крови кроликов, полученная через 20 часов после
кровопускания, стимулирует эритропоэз у нормальных кроликов-реципиентов. После
парентерального введения такой "анемической" сыворотки у животных развивался
эритроцитоз с нормобластической гиперплазией и увеличением числа митозов в
костном мозгу. Стимулирующее действие сыворотки авторы этого открытия объясняли
появлением в ней эритропоэтически активного вещества, названного ими
"гемопоэтином". Эритропоэтическая активность была обнаружена также и в сыворотке
крови животных, помещенных на несколько часов в барокамеру с низким парциальным
давлением кислорода, а также после введения гемолитического яда -
фенилгидразина.
В 30-х годах появились сообщения нескольких
авторов, которые отрицали или ставили под сомнение присутствие "гемопоэтина" в
сыворотке крови анемизированных или "гипоксических" животных. Эти работы на два
десятилетия значительно ослабили интерес ученых к концепции о гуморальной
регуляции эритропоэза. Однако в начале 50-х годов появились новые и оригинальные
данные, убедительно доказавшие существование "гемопоэтина". В 1950 г. Reissman
на парабиотических крысах доказал, что влияние гипоксии на костный мозг
осуществляется не прямым путем, а посредством образования гуморального фактора,
названного "эритропоэтином", объяснял неудачу некоторых прежних опытов слишком
малым количеством вводимой сыворотки. И действительно, Erslev в 1953 г. после
введения нормальным кроликам "анемической" плазмы по 50 мл ежедневно в течение 4
дней наблюдал на 5-6-й день от начала инъекций повышение числа ретикулоцитов в
3-4 раза, а после 13 инъекций - значительное увеличение числа эритроцитов,
величины гематокрита и процента эритроидных клеток в костном мозгу.
Дальнейшим толчком к изучению эритропоэтина
послужили клинические наблюдения над случаями вторичного эритроцитоза у
пациентов с незаращенным боталловым протоком (Stohlman, 1954). У этих пациентов
насыщение и давление О2 в крови подключичной артерии и в костном мозгу грудины
было нормальным, тогда как эти величины в бедренной артерии и в костном мозгу
подвздошной кости - значительно уменьшены. Однако и в нормально оксигенированном
костном мозгу грудины и в гипоксическом костном мозгу подвздошной кости была
обнаружена эритроидная гиперплазия. Эти наблюдения исключали прямое
стимулирующее влияние гипоксии на костный мозг и доказывали ее действие
посредством образования эритропоэтина.
Итак, эритропоэтин (ЭПО) образуется в
условиях гипоксии. Но в каком органе или в какой ткани? Вопрос о месте
образования ЭПО в организме был спорным и противоречивым, пока в 1957 г. в
лаборатории Jacobson не было обнаружено, что после двухсторонней нефрэктомии
крысы и кролики утрачивают способность реагировать на кровопускание или на
введение солей Co++ (вызывают тканевую гипоксию) повышением титра ЭПО в плазме.
Проведенные в дальнейшем многочисленные и разнообразные экспериментальные и
клинические наблюдения установили непреложный факт, что главным местом
образования ЭПО являются почки.
В 60-е годы появились первые работы по
изучению механизмов на клеточном и молекулярном уровнях, были разработаны
высокочувствительные методы определения ЭПО в сыворотке крови (с-ЭПО) и методы
клонирования коммитированных эритроидных предшественников - бурстобразующих и
колониеобразующих эритроидных единиц (БОЕ-Э и КОЕ-Э). В 1976 г. Международной
комиссией по биохимической номенклатуре (JUPAC-JUB) ЭПО был признан гормоном и
включен в Международную классификацию пептидных гормонов.
Гипоксия - главный стимул для образования
ЭПО. Под ее влиянием кислородный сенсор в почках индуцирует синтез гормона,
который поступает в циркуляцию крови и действует на клетки-мишени в костном
мозгу (БОЕ-Э и КОЕ-Э) В результате взаимодействия между ЭПО, ЭПО-чувствительными
клетками (ЭЧК) и их микроокружением возникает ответная реакция, а именно -
дифференциация, пролиферация и созревание эритроидных предшественников. Кроме
того, ЭПО предотвращает апоптоз эритроидных предшественников, то есть
способствует их выживаемости, уменьшая таким образом неэффективный эритропоэз.
Выделение гена
Молекулярно-генетический период истории ЭПО
начинается с успешного выделения и очистки нескольких миллиграммов гормона из
огромного количества мочи (1500 л) пациентов с апластической анемией в 1977 г.
По биохимической природе ЭПО относится к группе кислых гликопротеинов. Эти
соединения представляют собой белки, содержащие в качестве простетических групп
гетеросахариды с небольшим числом моносахаридных остатков, присоединенных
ковалентно к полипептидной цепи. Такие конзюгированные с углеводами белки
обладают характерной повышенной растворимостью и термостабильностью. Первичная
структура ЭПО стала известной в 1980 г. в связи с успехами в области
молекулярной биологии. Клонирование и экспрессия гена ЭПО, расположенного на
хромосоме 7 в области 11-22, позволили охарактеризовать молекулярные процессы
синтеза ЭПО. На модели "эндокринной" почки по Г.Селье было показано, что
биогенез ЭПО происходит по обычной схеме образования белка и включает в себя
депрессию синтеза РНК, специфичных для гормона (Е.Морщакова, 1978).
После успешного выделения и клонирования
ЭПО-гена в разных лабораториях были разработаны модели O2-ceнcopныx механизмов
экспрессии ЭПО-гена (Fandrey, 1990; Fisher, 1993). На основании предложенных
моделей можно сделать заключение, что существуют, вероятно, множественные пути
восприятия кислорода в ЭПО-продуцирующих клетках. Клеточные сенсоры О2 дают
возможность клеткам "зондировать" наличие кислорода в их окружении и
регулировать функции клетки-продуцента ЭПО. Эти функции направлены на ликвидацию
любого несоответствия между потребностями в кислороде и снабжением им. Наиболее
привлекательной гипотезой, на наш взгляд, является идея о вовлечении гемового
белка в молекулярные механизмы кислородного сенсора в ЭПО-продуцирующих клетках.
Механизмы могут быть связаны с окси-деоксиконформационными изменениями гемового
белка или с продукцией реактивных видов кислорода из молекулярного. Областью
почки, где располагаются О2-сенсорные и ЭПО-вырабатывающие клетки является
корковый слой.
Функции ЭПО передаются посредством
специфического ЭПО-рецептора (ЭПО-Р). Недавнее клонирование ЭПО-Р-гена
значительно облегчило молекулярный анализ структуры и функции этого рецептора.
Ген для ЭПО-рецептора обнаружен на хромосоме 19 у человека; он кодирует белок,
состоящий из 507 аминокислот и содержащий одну связанную с мембраной область.
ЭПО связывается с двумя молекулами ЭПО-Р. Это приводит к гомодимеризации
рецептора с последующей активацией нескольких путей сигнальной трансдукции
(передачи сигнала). ЭПО генерирует сигналы как для дифференциации, так и для
пролиферации эритроидных коммитированных предшественников. Эритроидная
дифференциация в молекулярном аспекте означает экспрессию генов, определяющих
синтез специфических белков эритрона, главным образом гемоглобина.
Нормальная функция системы эритрона
обусловлена тремя основными компонентами: нормальной почечной продукцией ЭПО,
функционирующим эритроидным костным мозгом и адекватным снабжением субстратами
(железом). Дефект какого-либо из этих компонентов может привести к развитию
анемии. Показателем почечной продукции ЭПО является содержание ЭПО в сыворотке
крови. Продукция ЭПО регулируется в узких пределах, и уровень с-ЭПО не
повышается за пределы нормы (6-25 мМЕ/мл) до тех пор, пока концентрация Hb не
падает ниже 100-120 г/л. При наличии нормального ЭПО-образующего аппарата в
почках уровни гормона в сыворотке повышаются экспоненциально уменьшению
концентрации Hb или гематокрита. В этих случаях почечная продукция ЭПО в ответ
на вызванную анемией гипоксию является адекватной. Примерами адекватной
продукции ЭПО могут быть: железодефицитная анемия, гемолиз, кровопотеря,
апластическая анемия, неэффективный эритропоэз. При неадекватной продукции ЭПО в
ответ на анемию наблюдается ослабление или даже утрата регулируемой зависимости
с-ЭПО от уровня Hb относительно такой зависимости у "эталонных" пациентов с
адекватной реакцией ЭПО на данную степень анемии. Как правило, в качестве
эталона используют корреляцию уровней с-ЭПО и Hb у пациентов с железодефицитной
анемией. Неадекватная продукция ЭПО наиболее часто наблюдается у пациентов с
хронической почечной недостаточностью, хроническими болезнями, злокачественными
новообразованиями.
"Клиническая эра"
Революционным событием в истории ЭПО стало
получение реком-бинантного человеческого ЭПО (рч-ЭПО) методами генной инженерии.
Разработка методов получения рч-ЭПО была кооперативной, многонациональной и
включала усилия ученых и специалистов фармацевтических компаний. Испытания
полученного препарата (эпоэтин-альфа) на животных, донорах-добровольцах и в
клинике были проведены в Европе, США, Канаде и в Японии и дали блестящие
результаты. Препарат оказался высокоэффективным и почти без побочных эффектов.
Первые публикации результатов клинических испытаний рч-ЭПО для лечения анемии
пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН) появились уже в 1986-87
гг. Результаты превзошли все ожидания, и началась "клиническая эра" ЭПО, который
стал использоваться для лечения целого ряда анемий с низкой и неадекватной
продукцией эндогенного гормона.
В настоящее время рекомбинантный
человеческими ЭПО является альтернативой гемотрансфузиям. Главными целями
применения рч-ЭПО являются: профилактика и лечение анемии, уменьшение или
исключение объема и количества гемотрансфузий и улучшение качества жизни
пациентов. Все препараты рч-ЭПО хорошо переносятся, дают высокий процент
ответной реакции (от 70 до 95% пациентов) и могут применяться в амбулаторных
условиях и даже на дому.
Клиническое применение рч-ЭПО
Заместительная терапия (низкий уровень
эндогенного ЭПО):
1. Хроническая почечная недостаточность.
2. Злокачественные новообразования.
3. Хронические болезни.
4. Недоношенность.
5. ВИЧ-инфекция.
6. Беременность.
Поддерживающая терапия:
1. После химио- и лучевой терапии.
2. После трансплантации костного
мозга/стволовых клеток.
Стимулирующая терапия (повышение Hb выше
нормы):
1. Хирургия (до и после операции).
2. Ситуации, когда запрещены
гемотрансфузии (например, у секты иеговистов).
Другие случаи:
1. Острая почечная недостаточность.
2. Критические состояния.
3. Нейропротекция.
4. Ишемическая болезнь сердца.
В нашем научно-клиническом центре (Рязанский
филиал) рч-ЭПО с успехом используется для лечения и профилактики анемии при
злокачественных новообразованиях, для лечения анемии недоношенных детей и анемии
хронических болезней, при критических состояниях. Наш 12-летний опыт применения
рч-ЭПО в педиатрической практике показал важность использования ряда критериев,
определяющих тактику ведения пациентов при ЭПО-терапии. Такими критериями
являются:
1. Уровень эндогенного (сывороточного)
ЭПО - с-ЭПО.
2. Уровень гемоглобина, гематокрита и
число ретикулоцитов.
3. Целевой уровень гемоглобина или
гематокрита, который планируется достичь в результате лечения.
Анализ этих критериев при различных видах
анемии позволяет спланировать дозировку и режим ЭПО-терапии. Рациональный
протокол применения рч-ЭПО особое значение имеет в детской клинике, где замена
гемотрансфузий на рч-ЭПО является одной из главных задач для врача.
В силу исторических и физиологических причин
активация и сигнализация системы ЭПО/ЭПО-Р хорошо изучены в эритроидных клетках.
Поэтому была принята догма, что ЭПО действует только на эти клетки. Однако
совсем недавно стало ясно, что ЭПО-Р экспрессируется во многих органах и тканях
(головной мозг, сердце, эндотелий, матка, женские и мужские репродуктивные
органы, глаз). Наиболее активно при этом изучалась биология ЭПО в ЦНС.
Оказалось, что ЭПО продуцируется нейронами и астроцитами и является биологически
активным. В паракринной системе мозга ЭПО связывается с рецептором на смежной
клетке и поэтому не поступает в циркуляцию крови. Система ЭПО/ЭПО-Р в ЦНС
оказывает антиапоптозное, антиоксидантное и прямое нейротрофическое действие, а
также стимулирует ангиогенез (капиллярные эндотелиальные клетки вырабатывают
нейротрофины).
Таким образом, существует, вероятно, три
отличных друг от друга системы действия ЭПО: 1) эндокринная, гормональная
система, в которой ЭПО действует как гормон (он вырабатывается в одной ткани и
транспортируется в плазме к ткани-мишени, 2) паракринная система, где клетки
вырабатывают ЭПО, который связывается с рецепторами на смежных клетках, 3)
аутокринная система, в которой сама клетка вырабатывает и использует ЭПО.
Экспрессия ЭПО-Р и ЭПО играет особенно важную
роль (кроме доминирующего значения в регуляции эритропоэза) в ЦНС. Различные
исследования свидетельствуют о том, что ЭПО оказывает трофический и защитный
эффекты в поврежденной ЦНС целым рядом механизмов, включая антиапоптозный и
антивоспалительный механизмы, а также иммунную и электрофизиологическую
модуляцию. Изменения в экспрессии ЭПО-Р играют ключевую роль в активации этих
механизмов. В исследованиях человеческого головного мозга после ишемии и/или
гипоксии ЭПО был определим в сосудистой ткани и в воспалительных клетках, а
ЭПО-Р обнаруживался в кровеносных сосудах и в отростках нейронов и астроцитов в
пределах инфарктов и в периинфарктной зоне. На моделях животных было показано,
что внутривенное введение рч-ЭПО оказывает нейропротекторное действие после
ишемии мозга, механической травмы, интоксикации, воспаления и дегенерации
мозговой ткани.
Система ЭПО/ЭПО-Р выполняет защитную роль не
только при повреждении ЦНС, но и при повреждениях других органов (например, при
ишемической болезни сердца). Таким образом, полное изучение системы ЭПО/ЭПО-Р
может значительно расширить терапевтическое использование рч-ЭПО не только для
лечения анемии, но и в направлении регенерации и восстановления поврежденных
тканей и органов.
Анатолий ПАВЛОВ,
профессор.
Елена МОРЩАКОВА,
профессор.
Рязанский филиал ФНКЦ
детской гематологии, онкологии и иммунологии.
